В начале XVI века в Кремле итальянскими мастерами строятся новые храмы: собор Чудова монастыря (1501—1503), собор Вознесенского монастыря (1519), церковь Иоанна Лествичника (1505—1508), церковь Николы Гостунского, перестраивается храм Иоанна Предтечи у Боровицких ворот (1504)[15][16].
Одновременно с сооружением Великокняжеского дворца и обновлением кремлёвских храмов шло строительство новых Кремлёвских стен и башен. Начиная с 1485 года на протяжении целого десятилетия под руководством итальянских зодчих белокаменные прясла стен и башни разбирались, а на их месте возводились новые из обожжёного кирпича. Площадь крепости была увеличена за счёт присоединения значительных территорий на северо-западе и достигла 27,5 га, а Кремль получил современные очертания неправильного треугольника[17]. Форма башен и завершения стены в виде зубцов напоминают замок Скалигеров в Вероне и замок Сфорца в Милане[14]. В 1508 году вдоль стен был вырыт Алевизов ров, вода в который поступала из Неглинной. Кремль окончательно превратился в неприступную, окружённой водой со всех сторон крепость, обособленную от разросшегося к тому времени города[15]. При реставрации стен и башен в 1946—1950 годах и в 1974—1978 годах внутри их кирпичной кладки, в нижних частях и фундаментах, были обнаружены белокаменные блоки, использованные в качестве забутовки. Возможно, что это и есть остатки белокаменных стен Кремля времени Дмитрия Донского.
В конце XV — начале XVI веков были отрегулированы и расширены основные кремлёвские улицы — Спасская, Никольская и Чудовская[18]. К тому времени в Кремле находилось ещё немало дворов бояр, духовенства и удельных князей, которые селились, в основном, на Подоле и к северу от Соборной площади. При Василии III и Иване Грозном, по мере обострения борьбы с удельными князьями, их дворы изымались великим князем и передавались его приближённым[15]. В XVI веке строительство в Кремле сводилось в основном к обновлению и совершенствованию уже существующих зданий и ансамблей. В 1532—1552 годах к колокольне Ивана Великого пристроили Воскресенскую церковь, в середине века перестроили Благовещенский собор, на Митрополичьем дворе появились церкви Соловецких чудотворцев и Трёх Святителей, неоднократно перестраивался и расширялся великокняжеский (затем царский) дворец. Иван Грозный долгое время жил на «опричном дворе» вне Кремля; после отмены опричнины для царя выстроили новые Постельные палаты в четыре покоя неподалёку от церкви Спаса на Бору[19].