Родился в 1754 году в Курске, в семье богатого именитого купца Исидора Мошнина и его жены Агафии. Рано потерял отца. В возрасте 7 лет упал с колокольни строящегося храма Сергия Радонежского, но остался невредим. В юном возрасте Прохор тяжело заболел. Во время болезни он увидел во сне Богородицу, пообещавшую его исцелить. Сон оказался правдивым: во время Крестного хода мимо его дома пронесли икону Знамения Пресвятой Богородицы, и мать вынесла Прохора, чтобы тот приложился к иконе, после чего он выздоровел.
В 1776 году совершил паломничество в Киев в Киево-Печерскую лавру, где старец Досифей благословил и указал ему место, где он должен был принять послушание и постриг — Саровскую пустынь. В 1778 году стал послушником у старца Иосифа в Саровском монастыре в Тамбовской губернии. В 1786 году принял монашество и был посвящён в иеродиаконы, в 1793 году рукоположен в иеромонаха.
В 1794 году, имея склонность к уединению, стал жить в лесу в келии в пяти километрах от монастыря. Подвиги его в это время были: телесные (носил одну и ту же одежду зимой и летом, сам добывал себе пропитание в лесу, спал очень мало, во многом имел строгое воздержание, пост), чтение книг (перечитывание Евангелия, святоотеческого писания), ежедневная долгая молитва, столпничество. Около келии Серафим развёл огород и устроил пчельник.
Житие сообщает о случае, как преподобный из рук кормил медведя хлебом. Однажды на него в лесу напали разбойники. Узнав, что к старцу часто приходят посетители, в том числе и вполне обеспеченные, бандиты решили ограбить келью. Напав на Серафима, они проломили обухом топора ему голову и сильно избили, в результате чего старец навсегда остался сильно сгорбленным. В келии для себя они ничего не нашли. Позже эти люди были установлены, но отец Серафим простил их и упросил не наказывать. В 1807 году принял на себя иноческий труд молчания, старался ни с кем не встречаться и не общаться. В 1810 году возвратился в монастырь, но ушёл в затвор до 1825 года. После окончания затвора принимал многих посетителей из монашествующих и мирян, имея, как сказано в житии, дар прозорливости и исцеления от болезней. Его посещали также знатные люди, в том числе царь Александр I. Ко всем приходящим к нему обращался словами «Радость моя!», в любое время года приветствовал словами «Христос воскресе!». Был основателем и постоянным покровителем Дивеевской женской обители. В 1831 году сподобился видения Богородицы в окружении Иоанна Крестителя, Иоанна Богослова и 12 дев. Скончался в 1833 году в Саровском монастыре в своей келии во время коленопреклоненной молитвы.
Стоит отметить, что икона Серафима Саровского написана с его прижизненного портрета, сделанного художником Серебряковым (впоследствии иноком Иосифом Саровской обители) за 5 лет до кончины старца.